以下文章来源于实验老司机 ，作者煲仔饭
单碱基编辑（Base Editing）是一种能够在基因组中直接实现碱基替换的技术，无需依赖DNA双链断裂（DSB）和同源重组修复。与CRISPR-Cas9系统相比，该技术具有更高的精确性和更低的脱靶风险，广泛应用于遗传疾病模型构建、功能基因组学研究及潜在基因治疗领域。
1 技术原理
单碱基编辑系统的核心由三个功能模块组成：
1. Cas9变体蛋白：通常使用dCas9（完全失去核酸酶活性）或nCas9（保留单链切口酶活性），通过向导RNA（sgRNA）靶向定位至目标DNA区域。
2. 脱氨酶：
胞嘧啶脱氨酶（如rAPOBEC1）：在CBE（Cytosine Base Editor）系统中催化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），后续DNA复制中U被识别为胸腺嘧啶（T），实现C→T（或G→A）的转换。
腺嘌呤脱氨酶（如TadA*变体）：在ABE（Adenine Base Editor）系统中催化腺嘌呤（A）转化为肌苷（I），复制后I被识别为鸟嘌呤（G），实现A→G（或T→C）的转换。
3. DNA修复抑制元件：尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI）可阻断尿嘧啶的切除修复，提高编辑效率。
碱基编辑策略：在由向导 RNA（绿色）指定的位点处具有靶标 C（红色）的 DNA 由 dCas9（蓝色）结合，从而介导局部 DNA 链分离。通过束缚的 APOBEC1 酶（红色）进行的胞苷脱氨将单链靶标 C→U 转化。
图片来源：doi: 10.1038/nature17946。
编辑过程：
1. sgRNA引导Cas9蛋白结合至目标DNA区域，形成R-loop结构，暴露单链DNA。
2. 脱氨酶对单链DNA中的特定碱基（C或A）进行化学修饰。
3. DNA复制或修复过程中，修饰后的碱基被固定为永久性改变。
2 实验材料
3 实验步骤
3.1 靶点设计与sgRNA合成
3.1.1 靶点筛选与验证
1. 编辑窗口的定位规则：
（1）坐标定义：
以sgRNA的5'端第一个核苷酸为第1位，向3'端依次编号
PAM序列（NGG）位于sgRNA的3'端下游，不计入sgRNA的20 bp序列
（2）不同编辑器的活性窗口：
（3）实验验证方法：
合成包含目标位点的DNA片段（如gBlock），通过体外编辑实验测定窗口效率
使用DeepBaseEdit预测活性窗口
2. 设计工具：
使用CRISPOR或Benchling输入目标基因序列（如NCBI Gene ID），设置以下参数：
PAM类型：NGG（适用于SpCas9变体）
sgRNA长度：20 bp（不含PAM）
编辑窗口优先级：
CBE系统：sgRNA第4-8位（以PAM远端为第1位）
ABE系统：sgRNA第4-7位
脱靶分析：勾选“全基因组脱靶扫描”，排除与其它基因同源性>80%的候选sgRNA
3. 示例靶点：
假设目标位点为人类HBB基因c.20A>T突变（镰刀型细胞贫血）：
靶序列：5'-GACGTGCGACTGAGGAGAAG[T]CTGC-3'（方括号内为突变位点）
设计sgRNA：5'-GACTGAGGAGAAGTCTGCGG-3'（下划线为编辑窗口，PAM为GG）
3.1.2 sgRNA oligo合成与退火
1. 合成要求：
上游引物（含Overhang）：5'-CACCG**N20**-3'（N20为sgRNA靶序列，不含PAM）
下游引物：5'-AAAAC**N20rev**-3'（N20rev为sgRNA靶序列反向互补）
2. 退火反应：
配制退火混合液（20 μL体系）：
3. 程序设置：95℃ 5min → 每分钟降温1℃至25℃ → 4℃保存
4. 稀释退火产物：用无菌水1:10稀释备用
3.1.3 sgRNA载体连接与验证
1. 载体酶切：使用BsmBI限制性内切酶（Thermo Fisher, #ER0451）切割pU6-sgRNA载体：
反应体系（50 μL）：
37℃孵育2h → 琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体
2. 连接反应：
体系（10 μL）：
bl3感受态细胞
3. 阳性克隆筛选：
挑取单菌落接种于LB培养基（含Amp抗性），37℃摇菌12h
提取质粒（使用Miniprep Kit）
Sanger测序验证（引物：U6-F: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'）
哺乳动物细胞中可能的碱基编辑结果：初始编辑导致 U:G 错配。尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 对 U 的识别和切除启动碱基切除修复 (BER)，从而导致恢复到 C:G 起始状态。BE2 和 BE3 会阻碍 BER，从而抑制 UDG。U:G 错配也由错配修复 (MMR) 处理，错配修复优先修复错配的缺口链。BE3 缺口包含 G 的未编辑链，有利于将 U:G 错配解决为所需的 U:A 或 T:A 结果。
图片来源：doi: 10.1038/nature17946。
3.2 细胞转染
3.2.1 细胞培养前处理
1. 培养基配置（以HEK293T为例）：
DMEM高糖培养基 + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素
细胞传代：当汇合度达80-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3min
2. 铺板参数：
6孔板：2×10^5 cells/孔（转染前24h铺板）
培养条件：37℃, 5% CO2, 湿度>90%
3.2.2 转染复合物制备（脂质体法）
1. 试剂配制（以Lipofectamine 3000为例）：
Tube A（DNA混合液）：
Tube B（脂质体混合液）：
2. 孵育条件：
将Tube A和Tube B分别涡旋5s
将Tube B缓慢加入Tube A，轻柔吹打混匀
室温静置15min（形成DNA-脂质体复合物）
3.2.3 转染
1. 吸除细胞培养基，加入1.5 mL新鲜培养基（不含抗生素）
2. 将250 μL转染复合物逐滴加入孔板，十字摇匀
3. 6h后更换为完全培养基（含抗生素）
4. 转染24h后：加入嘌呤霉素（终浓度1-2 μg/mL）
5. 每日观察细胞状态：
正常：细胞贴壁良好，增殖减缓但无大面积死亡
异常：若24h内细胞死亡率>90%，需降低筛选浓度
6. 筛选72h后：更换为正常培养基
3.2.4 终止培养与细胞收集
1. 转染后72小时（完成嘌呤霉素筛选），弃去培养基
2. 加入1×PBS（预冷至4℃）轻柔洗涤细胞2次（每次2 mL/孔，6孔板）
3. 加入0.25%胰蛋白酶-EDTA（含酚红）1 mL/孔，37℃孵育2-3分钟
4. 显微镜下确认细胞脱离后，加入2 mL完全培养基终止消化
5. 将细胞悬液转移至1.5 mL离心管，1000 rpm离心5分钟
6. 弃上清，细胞沉淀用200 μL PBS重悬备用
3.3 编辑效率检测
3.3.1 PCR扩增
1. 取适量细胞沉淀，使用试剂盒提取基因组DNA（如QuickExtract DNA Extraction Solution（Epicentre））
2. 引物设计：引物距离编辑位点至少50 bp（避免引物二聚体干扰）
示例引物：
Forward: 5'-CCTGTACCACAGCCTTAAGG-3'
Reverse: 5'-GTAGTCGGTGTCGGCTGATA-3'
3. 配制PCR反应体系（25 μL体系）：
4. 扩增程序：
预变性：95℃ 3min
35个循环：95℃ 30s → 60℃ 30s → 72℃ 45s
终延伸：72℃ 5min
3.3.2 T7E1酶切分析
1. 异源双链制备：
混合PCR产物（200 ng）与等量野生型DNA
95℃变性5min → 每分钟降温2℃至25℃
2. 酶切反应：
反应体系：
37℃孵育30分钟 → 加入6×Loading Buffer终止反应
3. 电泳分析：2%琼脂糖凝胶，120 V电泳30分钟
切割条带比例估算公式：
3.3.3 Sanger测序定量
1. PCR产物送测序，使用EditR（https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/）分析峰图
2. 计算公式：编辑效率=突变峰高度/(野生峰高度+突变峰高度)×100%
4 注意事项
4.1 sgRNA合成失败排查
无连接产物：检查BsmBI酶切效率（电泳确认载体线性化）
测序不匹配：重新设计引物避免回文结构
4.2 转染效率提升
低效处理：
增加DNA总量至3 μg/孔（需保持BE:sgRNA=3:1）
改用PEI转染（jetOPTIMUS®，Polyplus-transfection）
细胞毒性处理：
若转染后24小时细胞圆缩率>30%，降低脂质体用量20%
4.3 多靶点共转染
需控制总DNA量≤4 μg/孔
不同sgRNA质粒需使用不同抗性筛选标记（如sgRNA1用puromycin，sgRNA2用hygromycin）
5 参考资料
Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420-424.
Gaudelli, N. M., Komor, A. C., Rees, H. A., Packer, M. S., Badran, A. H., Bryson, D. I., & Liu, D. R. (2017). Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464-471.
Koblan, L. W., et al. (2021). Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nature Biotechnology, 39(5), 588-596.
Newby, G. A., & Liu, D. R. (2023). Base editing design guidelines using systematic target-sequence analysis. Nature Biotechnology, 41(5), 653-665.
Richardson, C. D., et al. (2016). Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology, 34(3), 339-344.
Brinkman, E. K., et al. (2014). Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research, 42(22), e168.
Doench, J. G., et al. (2016). Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology, 34(2), 184-191.
Ran, F. A., et al. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 8(11), 2281-2308.