我们在研究某个基因或蛋白功能的时候，敲降表达水平、抑制活性或阻断结合能力是我们的常规手段，这些手段一般对应着的则是siRNA（或shRNA）、小分子抑制剂（Pharmacological inhibitor）或中和抗体（Neutralizing antibody）。但这些分子如何选择，有时候真的是让人崩溃。
siRNA特异性好，目前外包合成也快，价格一般也不算高，但转染是个麻烦事，尤其是转巨噬细胞的时候，费老大劲都还是不行，最后还得改为慢病毒，成本就这样上去了。
小分子抑制剂是我觉得最经典的最方便的选择了，因为分子小，基本不挑细胞，价格也普遍能接受（主要指一些常见通路的抑制剂，偶有极个别例外）但是它经常让人困扰的就是多靶点这个痛点了，或者说脱靶或特异性不够高。但文献或产品资料里面经常写specific inhibitor，请千万不要被这个坑爹的描述给骗了！后面一段，我们来看看具体的例子。
中和抗体特异性也很高，但价格一般也很高，所以，穷课题组就别优先考虑这个了，尤其是要用于动物实验的情况下，除非刚好你这个中和抗体因为某些特殊原因莫名其妙地低。
按我个人经验，研究成果要往IF > 5的SCI期刊上发，两种抑制手段同时上是一个更好的选择，免得到时候审稿人挑刺抬杠了。
siRNA一般直接找第三方外包公司就行，基本不存在选择的问题。这几天让我不爽的主要还是小分子抑制剂和中和抗体选择的问题，随便查查搞搞，花一两天，哎！
重点以这两个案例来讲讲选择方法。
案例1：HSPA8
①先查找这个分子的基本信息——HSPA8是什么分子？有什么结构特征？如何发挥功能？
HSPA8，全称heat shock protein family A member 8，同HSC70或HSP73等一堆乱七八糟名字，它是一种分子伴侣，也是分子伴侣介导的自噬中的关键组分。它主要定位在细胞质和溶酶体，可以识别具有特定基序（如-KFERQ）的蛋白质，并将它们护送到溶酶体降解。然鹅，我们研究的这个HSPA8的假说机制是它在胞外作用到细胞膜上的，所以就只能找膜外调控机制的信息，然后再看经典的小分子抑制剂是否可以靶向相应的结构。运气还可以，有文献报道了HSPA8可以通过其C端的底物结合结构域（substrate binding domain，SBD）在胞外结合我们感兴趣的靶蛋白X。NBD（nucleotide-binding domain，核苷酸结合结构域）对调节肽结合和释放至关重要，这取决于其不同的ATP结合状态。在ATP与NBD结合的状态下，SBD结构域介导的底物结合亲和力较低，且SBD的“盖子”（lid）是打开的；在底物结合后，ATP被水解为ADP，SBD的“盖子”关闭，底物结合亲和力增加。反过来，SBD结构域通过与底物结合，也会影响NBD的ATP酶活性。NBD和SBD之间的连接肽参与结构域间的通信。根据这些背景信息，我们可以知道，阻断SBD和目标蛋白的结合可以更有效地抑制HSPA8活性。
②小分子抑制剂选哪个？
我们决定选择能结合HSPA8 SBD的pifithrin-μ，而不是结合NBD的VER-155008。但是，问题又来了：我们以HSPA8 inhibitor为关键词搜索的时候可以搜到pifithrin-μ，说它是specific inhibitor；但我们再以pifithrin-μ为关键词的时候，你会发现这玩意儿还TM可以通过减弱p53与Bcl-xL和Bcl-2的亲和力特异性抑制p53，及其线粒体分支通路，不影响其转录调控信号【1】。很多试剂网站是这种说法，但后经Gemini 3 Pro（https://sci.justscience.cn/chatgpt）提示，再仔细查阅文献发现了不一样的说法：pifithrin-μ与BAK, BCL-xL, GRP78, p53, HSC70或HSP90都不存在可检测到的互作，即使延长暴露时间【2】。Gemini 3 Pro说的是pifithrin-μ通过作用在HSP70上影响了其与p53互作，导致p53功能被抑制的，但是在这篇文章【2】中，我没看到相应的说法。但不管怎样，即使不与p53直接互作，pifithrin-μ也不仅仅抑制HSPA8，它抑制整个HSP70家族，包含至少13种蛋白【3】。所以，还是很坑！闭眼选的话，等到审稿阶段就更痛苦了。继续看看中和抗体吧！
③抗体选哪个？
看看中和抗体吧！因为HSPA8这个分子一般被认为胞内蛋白，不是分泌到胞外或膜上的蛋白，虽然常见，但还没像IL17A一样，被广泛作为一个治疗靶点，所以没有一些被广泛证实有高效抑制作用的抗体类药物，比如司库奇优单抗（Secukinumab）。那就先找找文献，以“neutralizing antibody HSPA8”为关键词在谷歌上找到了一篇文献【4】，里面所用中和抗体就是普通的用于实验检测的抗体，但是只写了“polyclonal rabbit IgG antibody; Abcam”，并没提供具体货号。所以只能继续查看哪个货号的抗体对应的免疫原含有HSPA8的SBD区域。Abcam官网上找到货号ab154415的抗体所用免疫原序列是人HSPA8 aa450到C-端序列（总共646个AA（氨基酸残基）），ab137808对应免疫原序列是人HSPA8 aa300-600，再继续从NCBI上查到aa394-509位是SBD（下图）。所以，用于生产ab154415抗体的免疫原含有HSPA8 SBD（共116个AA）中的60个AA，用于生产ab137808抗体的免疫原涵盖了完整SBD序列（包括底物结合口袋SBDβ和盖子 SBDα），所以ab137808这个抗体理论上包含能封闭底物结合口袋的抗体克隆的可能性更大（参考Gemini 3 Pro的意见写的）。
Abcam上两个HSPA8抗体信息
NCBI上人HSPA8氨基酸序列信息
综上，HSPA8用中和抗体更合适一些，但是价格有点高，官网价格100 μl装5400元，实际购买打个七八折，也得4000左右。pifithrin-μ 5 mg装400多，真香！小分子的非特异性问题是行业问题，咱也没办法，还是先用pifithrin-μ吧！实验结果如果不理想，我们再用抗体。
案例2：Calprotectin (S100A8/A9)
①先查找这个分子的基本信息
S100A8、S100A9这两个分子在我这两年的工作中经常遇到，比Calprotectin这个名字好像更常见，可能是因为和NETs的关系太密切。S100A8属于S100蛋白家族，通常与 S100A9 蛋白构成稳定且与受体亲和性更高的异二聚体 (S100A8/A9)复合物Calprotectin，该异二聚体在其许多功能中起着核心作用，包括NETs的释放。除了TLR4受体，S100A8/A9复合物的常见受体还有RAGE和CD36【5】。与其它受体相比，S100蛋白通常对TLR4受体更具有亲和性【5】。计算机模型计算结果发现，ClusPro生成的模型中，S100A8同源二聚体与TLR4的亲和性更高，结合自由能更低，而HADDOCK软件的结果显示S100A8/A9结合更好【5】。在S100A8/A9与TLR4结合时，S100A9发挥了关键作用，而S100A8几乎不与TLR4结合【5】。
②直接搜一下都有啥抑制剂
首先搜到的是Paquinimod (ABR-215757)，大量资料都说它阻断的是S100A8/A9复合物与受体的结合，但具体是怎么作用的？是作用在S100A8还是S100A9上？还是两者都有？还是其受体上？哎，又得查半天文献...经过一番文献考古，找了2009年的一篇论文【6】暗示了，ABR-215757（用这个名字搜能搜到更早期的文献）与S100A9的亲和力更强，比S100A8同源二聚体或S100A8/A9异源二聚体结合更紧密。继续查找资料发现，ABR-215757也可以靶向S100A12【7】，小分子抑制剂的通病。不过，好在我们研究的复合物中没有发现S100A12。
再看看另一个S100A8/A9抑制剂ABR-238901(与ABR-215757不是类似物，二者结构差异很大)：很多试剂公司网站或文献上说的它可以阻断S100A8/A9与RAGE或TLR4受体结合，也有文献说它是有效的S100A9抑制剂【8】，但未发现资料说它是S100A8的抑制剂。我猜很可能也主要是通过抑制S100A9发挥作用的，感兴趣的朋友可以自己再多查查。在我们目前的项目中选择Paquinimod（ABR-215757）即可。
③中和抗体选哪个？
我们的研究是暂定以S100A8/A9复合物为对象的，所以可以选用该复合物作为免疫原的抗体。我觉得也可以选S100A9抗体，因为它是Calprotectin中的关键亚基，但也存在一点问题：S100A9单体或S100A9同源二聚体可能也会收到影响。不过，最好都要有相关文献支持。
Abcam上好几个S100A8/A9复合物抗体的免疫原信息都是保密的，直接放弃。Bio-Techne货号为MAB45703或MAB45701的抗体的免疫原是S100A8/A9，据官网信息，它在ELISA实验中的是不会识别S100A8或S100A9单体的【9】。如果形成同源二聚体，这两个抗体是否可以识别，不得而知。
ThermoFIsher的6279-RBM5-P1这个抗体，从其名称推测，应该是可以结合S100A8/A9复合物和S100A9两种形态的蛋白【10】。至于中和效果，因为没查到相应的结合位点信息，这两个抗体都只能后面通过实验来验证了。另外，如果是只研究这个异源二聚体，要特异性识别这个复合物，不能受同源二聚体和单体的影响，估计就得自己参考文献【11】开发自己的抗体了。因为这个文章中并未直接测试或明确说明这些抗体对S100A8或S100A9同源二聚体的结合情况，所以开发的时候估计还得自己多加两个对照组。啊~心好累！
综上，还是先用便宜又好用的小分子抑制剂Paquinimod（ABR-215757），ABR-238901这个抑制剂可能是新产品，价格跟抗体差不多了，最小包装5 mg价格要3200了，果断放弃。
题外话：我经过了一番折腾选择确定了两个小分子抑制剂，别人根据文献直接也选择了两个小分子抑制剂，而客户是很难看出来区别的。类似的事情，在我们认真执行整个科研服务过程中是随处可见的，如果稍有不慎，留下隐患，将来客户文章发表遇到问题，这些锅，我们是非常难甩掉的。如何解决这个问题？方案一是彻底放弃整体课题的服务，方案二是选择一个普遍适用于多个课题的研究领域，深入做下去，这样相关细节会越来越熟悉，方案设计也是手到擒来，对应的实验也就更是不在话下了。目前我们技术服务团队选择的是方案二，因为直接放弃团队会饿死。我们的研究领域两年前定在了NETs（neutrophil extracellular traps, 中性粒细胞胞外诱捕网）相关领域，NETs诱导、提取、检测等操作已经驾轻就熟，希望对NETs感兴趣的朋友可以一起来交流。
这是个非常有意思的问题，答案是有的蛋白水平会降低，有的蛋白不降反增。案例：抑制剂AZD5363处理后p-Akt水平增加，以后有空再展开说说。
参考文献
1. https://agscientific.com/products/inhibitors/additional-inhibitors/pifithrin-%CE%BC-10-mg.html
2. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC2771108/ 这篇文章超级难找
3. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4837186/
4. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24501193/
5. https://doi.org/10.1007/s10930-024-10186-0
6. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC2671563/#pbio-1000097-g001
7. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3640742/
8. https://www.mdpi.com/1422-0067/25/18/9980/review_report
9. https://www.rndsystems.com/cn/products/human-s100a8-s100a9-heterodimer-antibody-900028_mab45703
10. https://www.thermofisher.cn/antibody/primary/query/S100A8/A9
11. https://www.jidonline.org/article/S0022-202X(25)00029-6/fulltext