目前，用安捷伦Seahorse细胞能量代谢分析仪检测耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）和胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）依然是行业内的金标准，相应成本依然很高，甚至因为厂家提价，不降反增，所以，在决定正式做Seahorse检测之前，采用相对便宜的其它预实验是一个更合理和更可操作的选择。这些实验主要包括：① 测OCR前，建议测ROS水平、线粒体膜电位（JC-1染色）、ATP或细胞活性（CCK-8）；② 测ECAR前，建议测乳酸或L-乳酸脱氢酶。
一、ROS水平检测
一般情况下，ROS的水平和OCR是成正相关的，因为是线粒体中总有一定比例的氧气消耗是用于生成ROS的。
1.1 ROS检测方法（荧光探针法）原理：
荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
1.2 ROS染色流式检测结果示例
▲图1 ROS 染色流式检测结果（图片来源：https://www.dojindo.cn/#/goodsDetails?gid=539）
这个检测可以用碧云天这个产品：活性氧检测试剂盒（货号：S0033M，链接：https://www.beyotime.com/product/S0033M.htm）。
二、线粒体膜电位（JC-1染色/流式定量）
2.1 JC-1染色检测线粒体膜电位原理：
JC-1 染色是一种用于检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的实验方法。JC-1 是一种阳离子脂质荧光染料，被广泛用作检测线粒体跨膜电位（ΔΨm）的指示剂。JC-1 在不同的线粒体膜电位下表现出不同的荧光特性。当线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体基质中，形成聚合物（J-aggregates），产生红色（或橙色）荧光。而当线粒体膜电位降低时，JC-1 不能聚集在线粒体基质中，以单体形式存在，产生绿色荧光。因此，通过观察荧光颜色的变化，可以方便地检测线粒体膜电位的变化。
2.2 JC-1染色流式检测结果示例：
这个方法中，线粒体膜电位是用含JC-1聚集体的细胞数比上含JC-1单体的细胞数来表示，它描述的是一个细胞群的特征。如图2所示，这里膜电位的算法是：ΔΨm = Q1-2/(Q1-2+Q1-4)。
▲图2 JC-1染色后流式定量分析结果
2.3 其它建议
虽然共聚焦拍出来的图很好看（图3），但不是很方便做定量分析，而且耗时耗力耗经费，所以JC-1染色后不建议拍免疫荧光照片。不过，如果你们课题组共聚焦显微镜很方便用，你又有时间、精力旺盛，而且不差钱，就当我没说。
▲图3 JC-1染色共聚焦拍照（来源：Cayman JC-1染色试剂盒说明书；货号1009172）
如果说只是想增加几张图凑凑数，显得实验结果多一点，可以用普通荧光显微镜拍几张，运气好的也能得到类似于下面的一些图（图4），也是可以的。
图4 JC-1染色后荧光拍照（图片来源：碧云天，货号C2003S，链接：https://www.beyotime.com/product/C2003S.htm）
一、胞外乳酸水平检测
1.1 商品化试剂盒：各种试剂盒到处都是，检测方法没啥可说的，可以用碧云天的试剂盒直接做，产品信息如下：
L-乳酸检测试剂盒(WST-8法)，链接：https://www.beyotime.com/product/S0208S.htm。
1.2 LC-MS/MS
这个方法，说实话，感觉有点大材小用了，但是经常用这个的大平台，比如我们吉诺生物，还是很简单很方便的。具体方法也没啥可说的，都是标准化的操作流程。
二、L-乳酸脱氢酶活性
L-乳酸脱氢酶相对于乳酸来说，是比较间接的。它是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可将丙酮酸还原为L-乳酸。这个也可以直接用碧云天的试剂盒，按protocol走就行了：
L-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法)，链接https://www.beyotime.com/product/P0393S.htm。
对待测细胞OCR、ECAR发生变化的可能性有很高的把握，也可以是依据一些已报道的结果，也可以是代谢组学、蛋白组学、或转录组学相关的结果。不过这些结果对OCR/ECAR可能变化这一推论的支持力度可能是不一样的，对于ECAR，我觉得代谢组学结果>蛋白组学结果>转录组学结果，而对于OCR，我觉得蛋白组学结果>代谢组学结果>转录组学结果。
那Seahorse检测后还可以再做哪些实验来进一步完善你的研究呢？等我有空了再说吧！我要去洗衣服了。